三聚氰胺检测试剂盒
使用前请仔细阅读说明书
产地:美国abraxis
应用
本试剂盒适用于污染样品中三聚氰胺的定量分析。
检测原理
本试剂盒的原理为竞争ELISA。利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。将三聚氰胺HRP标记物、标样及样品提取液加入包被三聚氰胺抗体的试验孔中孵育。在30分钟的孵育过程中，样品中的三聚氰胺与HRP标记物竞争结合三聚氰胺抗体。孵育完后，倾去孔内液体，洗涤除去未结合的三聚氰胺和HRP标记物。每孔加入清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。孵育20分钟后终止反应，读取各孔OD值。比较未知样品的OD值与标样的OD值，就可计算出样品中的三聚氰胺浓度。
提供的试剂及材料
试剂盒在2-8oC贮存，于盒上标注日期前用完。
1． 用铝箔袋真空包装的96孔板 （12×8条），内含指示干燥剂。
2． 浓度分别为 0, 20, 50, 100和 500 μg/L (ppb) 的4瓶三聚氰胺标准液。
3． 1 瓶 7 mL 三聚氰胺HRP酶标记物.
4． 1 瓶 14 mL 底物.
5． 1 瓶 14 mL 停止液. (注意! 1N 盐酸. 勿接触皮肤.)
注意事项
1． 最好配套使用所提供的试剂，不要同其它公司的产品混用，不要将不同批次的产品混用。
2． 不按试验步骤稀释试剂或样品将导致不准确的结果。
3． 不要使用过期的产品。
4． 使用之前将所有试剂恢复至室温20-280C，但不要放置超过24小时。
5． 三聚氰胺是有毒化学物质，请小心处理。
6． 终止液是1N盐酸，避免接触皮肤和黏膜。万一溅在皮肤上，立即用大量的水冲洗。
7． 与其它分析技术一样（GC、HPLC），阳性结果应用另一种替代方法确认。
试剂盒未提供的材料
1. 蒸馏水或去离子水
2. 可吸取50ul的移液器及吸头
3. 可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸头
4. 吸水纸或相当的吸水材料
5. 带450nm滤光片的酶标仪
6. 计时器
7. 洗瓶
8. 20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl 蒸馏水定容至1000ml
试验准备
I）潮饲料/湿猫粮的提取方法：稀释系数：100
1）用搅拌机均质样品直至呈糊状。
2）用10 mL 60% MeOH/水萃取2 g样品并剧烈涡旋振荡。
3）超声裂解样品1min。
4）再次涡旋振荡样品1min。静置5min使其分层。
5）10 000rpm离心10min。
6）用G6玻璃滤纸过滤清澈的上层相，然后用干净的瓶子储存提取液。
7）用样品稀释液将清澈的提取液稀释20倍（0.1mL+1.9 mL 10%MeOH/20mM PBS）
8）此稀释的样品可直接用于试验。
回收率介于75-117%。
II）干饲料/猫粮的提取方法：稀释系数：200
1）用搅拌机均质干猫粮样品。
2）称取1 g均质样品，加10 mL 60% 甲醇/水。
3）剧烈涡旋振荡后超声裂解样品1min。再次振荡1min后静置5min。
4）10 000rpm离心10min。
5）用G6玻璃滤纸过滤清澈的上层相，然后用干净的瓶子储存提取液。
6）用样品稀释液将清澈的提取液稀释20倍（0.1mL+1.9 mL 10%MeOH/20mM PBS）
7）此稀释的样品可直接用于试验。
检测步骤 (注意: 标准及样品最好做平行试验以增加准确度.)
1. 将所有试剂及样品置于室温下，用实验室级的水充满洗瓶。
2. 从铝箔袋中取出相应数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子以免微孔条受潮。
3. 吸取100ul标样或稀释的样品提取液到相应的微孔。每个样品使用一个新的吸头。每孔加50ul三聚氰胺HRP酶标记物。
4. 轻轻混合30秒，孵育30分钟。
5. 孵育完后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用洗液完全充满微孔，震荡后倒掉，重复三次，总共洗板四次。
6. 在吸水纸上拍打，尽可能将水拍干。
7. 每孔加入100ul底物溶液。
8. 孵育20分钟。
9. 每孔加入100ul终止液。
10. 用酶标仪读取450nm下的吸光值。
结果分析
1. 半定量的结果可通过样品吸光值与标样吸光值的简单对比而获得:样品的颜色比标样的颜色浅则三聚氰胺的浓度比标样的浓度高, 样品的颜色比标样的颜色深则三聚氰胺的浓度比标样的浓度低。
2. 定量分析需要绘制以标样吸光值为X轴,以标样的浓度的log值为Y轴的曲线图。画一条穿过标样点的直线，样品的吸光值位于该直线上。样品的吸光值在Y轴上的对应点为样品的浓度。如果样品吸光值大于最小标样的吸光值，则样品的浓度＜20 ppb；如果样品吸光值小于最大标样的吸光值，则样品的浓度＞500 ppb。
检测极限
预计本试剂盒的最小检测极限为10ppb。
特异性
三聚氰胺检测试剂盒与三嗪类似物的交叉反应可用最低检测剂量（LLD，约为90%B/Bo）或用抑制50%的吸光值所需的剂量（50%B/Bo