概述

黄曲霉毒素(Aflatoxin, AF）是由多种霉菌代谢的毒性产物，例如Asperillus flavus和Asperillus parasiticus霉菌。他们具有致癌性，存在于谷物、坚果、棉籽和其它食品或动物饲料中。谷物可能被黄曲霉毒素的衍生物：B1、B2、G1和G2其中一种或几种污染。AFB1是目前检测到的最毒的黄曲霉毒素，其他类型的黄曲霉毒素如果污染的浓度很高也存在很大的危险。黄曲霉毒素能够引发人类很多病症包括肝癌、黄曲霉中毒、莱耶综合症和慢性肝炎。动物容易摄取到黄曲霉毒素的原因是动物吃的饲料在生长、收割和贮存过程中可能被能够产生黄曲霉毒素的真菌污染。世界上大多数国家的政府已经对人类和动物性食品中制定了严格的黄曲霉毒素限量标准。

适用

REAGEN黄曲霉毒素分析测定试剂盒原理是竞争酶联免疫法，适用于检测谷物、坚果、棉花种子、加工过的谷类食物、和一些其它的动物食品中的黄曲霉毒素B1、B2、G1 和G₂。

原理

REAGEN黄曲霉毒素总量测定法是一种固相竞争酶联免疫分析测定方法。聚苯乙烯微孔板中包被抗黄曲霉毒素的高亲和力抗体，这种抗体和黄曲霉毒素的四种亚型都能发生交叉反应）。利用70%甲醇提取样品中的黄曲霉毒素，把提取的样品和HRP（辣根过氧化物酶）标记的黄曲霉毒素B1混匀并加入对应的孔检测。酶标记毒素与标准品或者样品中黄曲霉毒素竞争与包被在微孔底部的抗体结合。孵育一段时间后，倒出孔里的液体，清洗后加入显色底物，在酶的作用下孔里将会出现蓝色。显色颜色的深浅与结合物的量成正比例的关系，与标准品或样品中AFM的量成反比例关系。所以，标准品或样品中的AFM浓度越高，显色的蓝色将会越浅。加入酸，终止反应，底物颜色由蓝色变为棕黄色。微孔板放进酶标仪里，在OD_450nm读取吸光度值。样品的吸光度值与试剂盒中标准OD值相比较，相对应得出结果。

试剂盒组成

1×小袋	抗体包被的微孔板	96孔板（12×8微孔板用鼠源AF单克隆抗体）
1×	预混板（绿色）	96孔板（12×8）没有包被抗体
6×小瓶	AFM标准品	1.5mL/瓶，AFM的浓度分别为0.0、0.2、0.5、 1．0、2.0、4.0ng/mL 溶解在有机溶液中。
2×小瓶	HRP-AF偶联物	2 x 12mL HRP-AFB1添加防腐剂 的缓冲溶液，可以直接使用
1×小瓶	底物试剂	15mL TMB，可以直接使用
1×小瓶	终止液	15mL酸性液体，可以直接使用

样品提取步骤

1.制备提取液：70%甲醇，用蒸馏水或无离子水稀释（每个样品需要100ml样品提取液）。

2.研磨样品（使50%的样品可以通过一个20目的滤网）。

3.称量20g研磨过滤后的样品加入100ml样品提取液，样品稀释比为1:5(w/v)。

4.在混合器上至少震荡2分钟。

5.用滤纸过滤5-10ml 以上处理的液体，收集滤液待测。

样品测定步骤

1、使用前将试剂拿到室温。

2、取出混合板放于微孔支架上用于标准和样品的测试，取相同数量的微孔（包被有抗体）置于另一个微孔支架上。

3、在每个混合板微孔中加入 200μl酶标结合物。

4、在对应的孔中加入100μl标准或样品，用枪头混合3次，

注意：操作者要把每个孔标记清楚

5、转移100ul预混板微孔中的液体到对应的包被有抗体的微孔中，室温孵育15分，最好使用多道移液器。

6、将孔里的液体倒入合适的容器中，用蒸馏水或无离子水洗板，然后迅速弃掉洗液到合适的容器中，重复洗5次。在一层厚的吸水纸上拍板，去掉残留的洗液。

7、在吸水纸上拍打，尽可能地将水拍干。

8、每孔加入100μl底物溶剂，室温孵育5min。

9、每孔加入100μl终止液。

10、对比标准和样品的颜色，或在OD450 nm读数。

结果分析

使用原有的OD值或实验获得的OD值与标准曲线中黄曲霉毒素浓度为0时OD值的百分比值与标准中黄曲霉毒素含量建立剂量效应曲线。通过在标准品曲线中添加新数值计算被测物质中黄曲霉毒素的浓度。因为样品在处理的过程中稀释了5倍，所以实际值是测定值的5倍。样品在标准曲线上的稀释范围是1-20ppb，如果样品的浓度大于最高标准，需要用70%的样品提取液来稀释后再测定，计算结果时要考虑到稀释的倍数。