三聚氰胺檢測試劑盒
使用前請仔細閱讀說明書
產地:美國abraxis
應用
本試劑盒適用於污染樣品中三聚氰胺的定量分析。
檢測原理
本試劑盒的原理為競爭ELISA。利用萃取液通過均質及振盪的方式提取樣品中的三聚氰胺進行免疫測定。將三聚氰胺HRP標記物、標樣及樣品提取液加入包被三聚氰胺抗體的試驗孔中孵育。在30分鐘的孵育過程中，樣品中的三聚氰胺與HRP標記物競爭結合三聚氰胺抗體。孵育完后，傾去孔內液體，洗滌除去未結合的三聚氰胺和HRP標記物。每孔加入清澈的底物溶液，結合的酶標記物將無色的底物轉化為藍色的物質。孵育20分鐘后終止反應，讀取各孔OD值。比較未知樣品的OD值與標樣的OD值，就可計算出樣品中的三聚氰胺濃度。
提供的試劑及材料
試劑盒在2-8oC貯存，于盒上標註日期前用完。
1． 用鋁箔袋真空包裝的96孔板 （12×8條），內含指示乾燥劑。
2． 濃度分別為 0, 20, 50, 100和 500 μg/L (ppb) 的4瓶三聚氰胺標準液。
3． 1 瓶 7 mL 三聚氰胺HRP酶標記物.
4． 1 瓶 14 mL 底物.
5． 1 瓶 14 mL 停止液. (注意! 1N 鹽酸. 勿接觸皮膚.)
注意事項
1． 最好配套使用所提供的試劑，不要同其它公司的產品混用，不要將不同批次的產品混用。
2． 不按試驗步驟稀釋試劑或樣品將導致不準確的結果。
3． 不要使用過期的產品。
4． 使用之前將所有試劑恢復至室溫20-280C，但不要放置超過24小時。
5． 三聚氰胺是有毒化學物質，請小心處理。
6． 終止液是1N鹽酸，避免接觸皮膚和黏膜。萬一濺在皮膚上，立即用大量的水沖洗。
7． 與其它分析技術一樣（GC、HPLC），陽性結果應用另一種替代方法確認。
試劑盒未提供的材料
1. 蒸餾水或去離子水
2. 可吸取50ul的移液器及吸頭
3. 可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭
4. 吸水紙或相當的吸水材料
5. 帶450nm濾光片的酶標儀
6. 計時器
7. 洗瓶
8. 20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl 蒸餾水定容至1000ml
試驗準備
I）潮飼料/濕貓糧的提取方法：稀釋係數：100
1）用攪拌機均質樣品直至呈糊狀。
2）用10 mL 60% MeOH/水萃取2 g樣品並劇烈渦旋振盪。
3）超聲裂解樣品1min。
4）再次渦旋振盪樣品1min。靜置5min使其分層。
5）10 000rpm離心10min。
6）用G6玻璃濾紙過濾清澈的上層相，然後用乾淨的瓶子儲存提取液。
7）用樣品稀釋液將清澈的提取液稀釋20倍（0.1mL+1.9 mL 10%MeOH/20mM PBS）
8）此稀釋的樣品可直接用於試驗。
回收率介於75-117%。
II）干飼料/貓糧的提取方法：稀釋係數：200
1）用攪拌機均質干貓糧樣品。
2）稱取1 g均質樣品，加10 mL 60% 甲醇/水。
3）劇烈渦旋振盪后超聲裂解樣品1min。再次振盪1min后靜置5min。
4）10 000rpm離心10min。
5）用G6玻璃濾紙過濾清澈的上層相，然後用乾淨的瓶子儲存提取液。
6）用樣品稀釋液將清澈的提取液稀釋20倍（0.1mL+1.9 mL 10%MeOH/20mM PBS）
7）此稀釋的樣品可直接用於試驗。
檢測步驟 (注意: 標準及樣品最好做平行試驗以增加準確度.)
1. 將所有試劑及樣品置於室溫下，用實驗室級的水充滿洗瓶。
2. 從鋁箔袋中取出相應數量的微孔條，放入乾燥劑並重新封好袋子以免微孔條受潮。
3. 吸取100ul標樣或稀釋的樣品提取液到相應的微孔。每個樣品使用一個新的吸頭。每孔加50ul三聚氰胺HRP酶標記物。
4. 輕輕混合30秒，孵育30分鐘。
5. 孵育完后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用洗液完全充滿微孔，震盪后倒掉，重複三次，總共洗板四次。
6. 在吸水紙上拍打，盡可能將水拍干。
7. 每孔加入100ul底物溶液。
8. 孵育20分鐘。
9. 每孔加入100ul終止液。
10. 用酶標儀讀取450nm下的吸光值。
結果分析
1. 半定量的結果可通過樣品吸光值與標樣吸光值的簡單對比而獲得:樣品的顏色比標樣的顏色淺則三聚氰胺的濃度比標樣的濃度高, 樣品的顏色比標樣的顏色深則三聚氰胺的濃度比標樣的濃度低。
2. 定量分析需要繪製以標樣吸光值為X軸,以標樣的濃度的log值為Y軸的曲線圖。畫一條穿過標樣點的直線，樣品的吸光值位於該直線上。樣品的吸光值在Y軸上的對應點為樣品的濃度。如果樣品吸光值大於最小標樣的吸光值，則樣品的濃度＜20 ppb；如果樣品吸光值小於最大標樣的吸光值，則樣品的濃度＞500 ppb。
檢測極限
預計本試劑盒的最小檢測極限為10ppb。
特異性
三聚氰胺檢測試劑盒與三嗪類似物的交叉反應可用最低檢測劑量（LLD，約為90%B/Bo）或用抑制50%的吸光值所需的劑量（50%B/Bo