碧波TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)(通用型,適用於細胞、組織樣本)
一、產品簡介
TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對於待檢測的細胞或組織樣品,經過生物素標記和後續的DAB顯色等步驟,即可在普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞。
細胞在發生凋亡時,會激活一些DNA內切酶,這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測,可以發現180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時,暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標記的dUTP(Biotin-dUTP),隨後和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結合,最後在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞;由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3'-OH形成,很少能夠被標記。這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理。
本試劑盒適用於組織樣本(石蠟包埋、冰凍和超薄切片)和細胞樣本(細胞塗片)的凋亡原位檢測。
本試劑盒有如下優點:
1、 高靈敏度:可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡,同時由於凋亡早期就有DNA斷裂,可以檢測到早期的細胞凋亡。
2、 操作簡便:使用Ready-to-Use型試劑,並配有Proteinase K 和DAB。
3、 特異性:TUNEL檢測時通常更容易標記凋亡細胞,而不容易標記坏死細胞。
4、 快速:僅需約3個小時即可完成。
5、 應用範圍廣:可以用於檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況,也可以檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。
6、 方便觀察:使用光學顯微鏡觀察實驗結果,無需貴重設備。
二、試劑盒組份
組 份
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Cat: BA2020
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Cat: BA2050
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Cat: BA20100
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儲存條件
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平衡液
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1.0 mL
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2.5 mL
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5.0 mL
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-20℃
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TdT酶
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80μL
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200μL
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400μL
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-20℃
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50×蛋白酶 K
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40μL
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100μL
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200μL
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-20℃
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Streptavidin-HRP
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10μL
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25μL
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50μL
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4℃避光
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Biotin-dUTP
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20μL
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50μL
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100μL
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-20℃
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DAB
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2mg
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5mg
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10 mg
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-20℃避光
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三、試劑盒以外自備儀器和試劑
二甲苯、多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、檸檬酸鈉、復染染液:甦木素或甲基綠等;
蓋玻片、載玻片、染色缸、染色濕盒、光學顯微鏡、37℃孵箱、移液器等。
四、保存條件:
-20℃保存,Streptavidin-HRP和DAB需避光保存。
五、注意事項:
1、TUNEL法特異性檢測細胞凋亡時產生的DNA斷裂,但不會檢測出射線等誘導的DNA斷裂(和細胞凋亡時的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和坏死區分開,另一方面也不會把射線等誘導發生DNA斷裂的非凋亡細胞判斷為凋亡細胞。
2、極少數細胞凋亡時沒有DNA斷裂,此時不適用TUNEL法檢測。在個別類型的坏死細胞中也發現TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴格判斷細胞凋亡的情況下,最好同時檢測多個凋亡指標。
3、使用前請認真閱讀本說明書,提前準備好相關試劑。
4、因本試劑盒中組分均為微量,使用前請離心。
5、為避免試驗誤差、降低試劑的損耗,建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭。
6、 TdT 酶反應液最好在使用前根椐樣本數量集中配製,再分別滴加于各樣本片上,避免每個樣本單獨配製而產生的試劑損耗。
7、為防止樣本脫落,請使用硅烷(Silane)處理的載玻片或採用多聚賴氨酸鋪片。
8、DAB為固體粉末,使用前加入PBS配製成20×DAB(10 mg/ml)后,按說明書顯色使用。
9、為了您的安全和健康,請穿實驗服並戴一次性手套操作。
六、操作規程
A、檢測樣本的預處理
TUNEL檢測時樣本的預處理是試驗的關鍵所在,本說明書推薦的條件僅為普遍情況,用戶需根椐自已的樣
本材料及首次試驗結果來調整各個條件,如處理時間、處理濃度等,來優化出適合自身樣本的試驗條件,從而做出客觀的試驗結果。
1、 對於細胞樣本
a、 把準備好的細胞塗片或爬片自然晾乾。
b、 把晾乾的樣本浸入固定液,室溫(15-25℃)固定15-60min。
(固定液的配製:4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中,需新鮮配製)
c、 把固定好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
d、 把c步處理好的樣本浸入封閉液中,室溫(15-25℃)封閉10min。
(封閉液的配製:3%H2O2溶于無水甲醇)
e、 把d步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
f、 把e步處理好的樣本浸入通透液中,冰上(2-8℃)促滲2min。
(通透液的配製:0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉,需新鮮配製)
g、 然後轉入B步驟標記和顯色反應。
注意事項:
a、 為防止樣本脫落,請使用硅烷(Silane)處理的載玻片或採用多聚賴氨酸鋪片。
b、 固定好的樣本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分鐘或過夜,以改善細胞的滲透性。
c、 使用PBS漂洗細胞樣本時,不要直接加在細胞樣本上,以防止細胞樣本的脫落。
d、 固定液、PBS、封閉液、通透液、染色缸需用戶自備,請按上述方法配製。
2、 對於石蠟切片
a、 按常規方法將石蠟切片進行脫蠟及水合
(如:二甲苯脫蠟2次,每次5-10 min;乙醇水合(將脫蠟好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min))
b、 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
c、 把b步處理好的樣本加入蛋白酶K工作液, 21-37℃作用15-30min。
(蛋白酶K工作液的配製:2μL 50×蛋白酶K+98μL PBS)
d、 把c步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
e、 把d步處理好的樣本浸入封閉液中,室溫(15-25℃)封閉10min。
(封閉液的配製:3%H2O2溶于甲醇)
f、 把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次,每次5min。
g、 然後轉入B步驟標記和顯色反應。
注意事項:
a、 蛋白酶K處理的使用濃度、處理時間及溫度,都因組織的類型不同而有所不同,需要自已摸索優化上述條件,如有問題,請根椐本說明書的《常見問題的原因及推薦解決方案》來調整條件。例如:如果凋亡細胞染色較弱時,可用高濃度的Proteinase K(400μg/mL)處理5分鐘。(本試劑盒的50×Proteinase K濃度為1mg/mL)。
b、 其它替代方法:石蠟切片的預處理也可根椐實際情況可採用下述三種替代方法之一,即蛋白酶K處理的步聚改用下述方法,其餘步聚均相同:
替代方法1:
將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10 min(通透液的配製:0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉,需新鮮配製)
替代方法2:
將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min(胃蛋白酶溶液的配製:0.25%-0.5%溶于HCl PH2;胰蛋白酶溶液的配製:0.25%-0.5%溶于0.01N HCl )
替代方法3:
將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩衝液PH= 6 的塑料盒中,置於微波爐中350W(低檔)處理5 min。為防止樣本脫落,請使用硅烷(Silane)處理的載玻片或採用多聚賴氨酸鋪片。
c、 使用酶處理切片時一定要把酶洗滌乾淨,否則會嚴重干擾後續的標記反應。
3、 對於冷凍切片
a、 把冰凍切片浸入固定液,室溫(15-25℃)固定30min。
(固定液的配製:4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中,需新鮮配製)
b、 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次,每次15min。
c、 把b步處理好的樣本浸入封閉液中,室溫(15-25℃)封閉10min。
(封閉液的配製:3%H2O2溶于甲醇)
d、 把c步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次,每次5min。
e、 把d步處理好的樣本浸入通透液中,冰上(2-8℃)促滲2min
(通透液的配製:0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉,需新鮮配製)
f、 然後轉入B步驟標記和顯色反應。
4、對於難處理的切片
a、 按常規方法將石蠟切片進行脫蠟及水合
(如:二甲苯脫蠟2次,每次5-10 min;乙醇水合(將脫蠟好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min))
b、 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次,每次5min。
c、 把b步處理好的樣本加入浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩衝液PH= 6 的塑料盒中,置於微波爐中750W(高檔)處理1 min。
d、 迅速加入80ml雙蒸水(20-25℃)加入c步處理好切片的塑料盒中,冷卻至室溫,將組織切片轉移至PBS(20-25℃)中。
e、 把d步處理好的樣本浸入封閉液中,室溫(15-25℃)封閉10min。
(封閉液的配製:0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清)
f、 把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次,每次10min。
g、 然後轉入B步驟標記和顯色反應。
5、陽性對照及陰性對照的準備
TUNEL檢測同時需要設陽性和陰性對照,以顯示試驗的客觀性及準確性。因此需要按下述方法準備兩個樣本來制備陽性及陰性片,其後續步聚與待測樣本同樣進行。
a、陽性對照樣本的準備
樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后,細胞樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后,再加入100μL DNase I反應液(用戶自備)室溫—37℃處理10 -30 min,其餘步驟均相同。
(DNase I反應液的配製:10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2)
b、陰性對照樣本的準備
在標記反應的過程中不添加TdT酶反應液,其餘步驟均相同。
B、 標記和顯色反應:
1、 預處理好的樣本PBS漂洗2次,每次5min后,樣本週圍用濾紙或吸水紙吸干。
2、 配製TdT酶反應液:
參考下表配製適當量的TdT酶反應液(根據需要按照比例放大),需充分混勻。注意:配製好的TdT酶反應液必須一次使用完畢,不能凍存。
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1個樣品
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5個樣品
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10個樣品
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平衡液
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45µl
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225µl
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450µl
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Biotin-dUTP
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1µl
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5µl
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10µl
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TdT酶
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4µl
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20µl
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40µl
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TdT酶反應液總體積
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50µl
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250µl
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500µl
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3、 每個樣本滴加50μL TdT酶反應液,加蓋玻片37℃避光濕潤反應60min。(陰性對照片不加TdT酶)
4、 把第3步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
5、 Streptavidin-HRP及DAB工作液的配製:
Streptavidin-HRP工作液的配製:
參考下表配製適量的Streptavidin-HRP工作液,需充分混勻。注意:配製好的Streptavidin-HRP工作液必須一次使用完畢,不宜凍存。
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1個樣品
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5個樣品
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10個樣品
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Streptavidin-HRP
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0.5µl
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2.5µl
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5µl
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PBS
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99.5µl
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497.5µl
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995µl
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Streptavidin-HRP工作液總體積
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100µl
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500µl
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1000µl
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DAB工作液的配製:
a、先把試劑盒中DAB粉末用PBS溶解配製成20×DAB(10 mg/ml),配製方法如下:
DAB
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2mg
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5mg
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10mg
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PBS
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0.2ml
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0.5ml
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1.0ml
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配製成20×DAB(10 mg/ml),放于-20℃保存
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b、DAB工作液的配製:
參考下表配製適量的DAB工作液,需充分混勻。注意:配製好的DAB工作液必須一次使用完畢,不宜凍存。
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1個樣品
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5個樣品
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10個樣品
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20×DAB(10 mg/ml)
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5µl
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25µl
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50µl
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30%H2O2
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1µl
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5µl
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10µl
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PBS
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94µl
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470µl
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940
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DAB工作液總體積
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100µl
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500µl
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1000µl
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6、 將第5步處理好的樣本週圍用濾紙或吸水紙吸干,再滴加50μL Streptavidin-HRP工作液,加蓋玻片37℃濕潤避光反應30min。
7、 把第6步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min,樣本週圍用濾紙或吸水紙吸干。
8、 將第7步處理好的樣本滴加50μL-100μL DAB工作液,室溫孵育5-30分鐘或根據顯色情況孵育適當時間。注意:如果顯色很強可以短于5分鐘即停止顯色,如果顯色很弱,可以適當延長顯色時間,甚至顯色過夜。
9、 把第8步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min,可直接光學顯微鏡下觀察、拍照。
10、選做(本步驟可不做):用甦木素染色液或甲基綠染色液進行細胞核染色。隨後用PBS漂洗3次,每次5min,光學顯微鏡下觀察、拍照。
操作注意事項:
1、 PBS清洗后,為了各種反應的有效進行,請儘量除去PBS溶液后再進行下一步反應。
2、 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后,請蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進行,這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體,又可以防止反應液乾燥造成實驗失敗。
3、 TdT酶反應液即用即配,短暫于冰上保存。不宜長期保存,長期保存會導酶活性的失活。
4、 如果20×DAB溶液顏色變深成為紫色,則不可使用,需重新配製。
5、 甦木素復染:將切片放入甦木素染液,染色 30min ,蒸餾水沖洗乾淨后放入鹽酸甲醇溶液中5s,立即用蒸餾水沖洗乾淨。分別用70%、85%、95%、無水乙醇浸泡5min。用二甲苯浸泡10min,更換二甲苯后再浸泡10min。晾乾后在切片上加中性樹膠,加蓋玻片。
七、常見問題的原因及推薦解決方案.
現象
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可能原因
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建議
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非特異性染色
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TdT酶的濃度過高
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用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀釋
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TdT酶反應時間過長或TdT酶反應過程中反應液滲漏,細胞或組織表面不能保持濕潤。
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注意控制反應時間,並確保TdT酶反應液能很好地覆蓋樣品。
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光照紫外線導致包埋試劑的聚合(如:甲基丙烯酸會導致樣本DNA的斷裂)
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嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑
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在固定組織時樣本DNA已斷裂(內源核酸酶的作用)
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確保樣品取樣后立即固定或通過肝靜脈灌注固定
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使用了不適當的固定液,例如一些酸性固定液
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採用推薦的固定液
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固定後某些核酸酶活性依然較高導致DNA斷裂
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用含有dUTP和 dAPT的溶液封閉
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標記率低
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如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標記效率較低(因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯,而在操作中丟失)
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用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定
或福爾馬林或戊二醛固定。
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固定時間過長,導致交聯程度過高
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減少固定時間,或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
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熒光淬滅
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Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅,需注意避光操作
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促滲條件不佳,以致于試劑不能到達靶分子或濃度過低
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1、 增加通透劑促滲時間
2、增加通透劑的作用溫度(15-25℃)
3、優化蛋白酶K的作用濃度和作用時間(如:以400ug/ml作用5min)
4、0.1M的檸檬酸鈉70℃作用30min。
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選擇的染料不合適
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用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%甲基綠PH4.0,或甦木素復染
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染色背景很高
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支原體污染
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請使用支原體染色檢
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