碧波DNA Ladder檢測試劑盒
一、產品簡介
DNA ladder也稱DNA fragmentation,是細胞凋亡的一個重要指標。通常觀察到DNA ladder,就可以判定細胞發生了凋亡。在細胞發生凋亡時,核酸內切酶被激活,選擇性降解染色質DNA,形成50-300 kb的大片段,並進而在核小體連接處斷裂,形成180-200 bp或其整倍數的DNA片段,這些DNA片段可從細胞中提取出來,通過瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色呈現為梯狀條帶(DNA Ladder),並據此判斷細胞凋亡產生。DNA Ladder檢測試劑盒提供了一種簡便、快速地提取染色質DNA的方法,並增加對小片段DNA的回收,從而增強了檢測的敏感性。
本試劑盒可應用於培養細胞凋亡檢測(不推薦用於檢測組織樣本)。
二、試劑盒組份
組份
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Cat:BA1520
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Cat: BA1550
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Cat: BA15100
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儲存條件
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裂解液
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4 mL
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10 mL
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20 mL
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4℃
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溶液A
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400μL
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1.0 mL
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2.0 mL
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4℃
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酶1
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400μL
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1.0 mL
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2.0 mL
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-20℃
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酶2
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400μL
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1.0 mL
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2.0 mL
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-20℃
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沉澱液
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3.0 mL
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6.5 mL
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13.0 mL
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4℃
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上樣液
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80μL
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0.2 mL
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0.4 mL
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4℃
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三、試劑盒以外自備儀器和試劑
高速離心機、移液器、渦旋振盪器、電泳儀、水浴鍋,1.5m L 離心管、PBS、胰酶消化液、冰乙醇、TE Buffer,瓊脂糖,TBE、溴化乙啶、DNA Ladder Marker
四、保存條件:
酶-20℃保存。其他溶液可4℃保存
五、注意事項:
1、DNA Ladder出現在細胞凋亡晚期,觀察細胞形態已發生皺縮出芽,染色質完全凝聚,細胞核已固縮斷裂的凋亡晚期形態,建議該種形態的凋亡細胞比例在30%以上時進行DNA Ladder檢測或先進行Tunel檢測,
2、 DNA Ladder出現在一個較短的時間段,在凋亡早期取樣,則無DNA降解的條帶,而在凋亡末期取樣則產生與細胞坏死相似的DNA彌散條芾。因此取樣時間需根椐不同種類的細胞和誘導劑而摸索確定。
3、貼壁細胞最好不用胰酶消化而用細胞刮收集。
4、某些細胞不產生這種核小體間的DNA斷裂,而是產生50-300kb的大片段斷裂。
5、為了您的安全和健康,請穿實驗服並戴一次性手套操作。
六、操作規程
1、 按常規操作離心收集準備好的105~106細胞(1500×g,離心5min)于1.5mL離心管中;
2、 用PBS洗滌細胞二次(1500×g,離心5min),棄上清;
3、 沉澱的細胞中加入100μL裂解液,渦旋振盪器上劇烈混合10秒,離心(1000×g, 5min)后轉移上清于另一1.5mL離心管中;
4、 沉澱再加入100μL 裂解液重複第3步,合併兩次的上清液;
5、 在上述合併的上清液中加入20μL 溶液A,再加入20μL 酶 A,輕輕混勻后于55℃反應1小時;
6、 加入20μL 酶 B,輕輕混勻后于37℃孵育1小時;
7、 加入130μL 沉澱液和950μL冰乙醇, 混勻,置-20℃,1小時以上或過夜;
8、 4℃,離心(12,000-14,000 rpm, 15-30min),小心地移棄上清,收集沉澱的DNA;
9、 加入0.5mL 70%的冰乙醇,洗滌DNA沉澱,再離心(12,000-14,000 rpm, 20min);
10、棄上清,DNA沉澱于室溫乾燥10 min后,加入10-15μL TE Buffer,充分溶解DNA;
11、取上述10-15μL樣品加入2-3μL 上樣液, 1.5%瓊脂糖凝膠電泳(凝膠和電泳緩衝液TBE均加入0.5μg/mL的溴化乙啶);
12、5V/cm電泳1小時,紫外燈下觀察並拍照。