一、 原理
本試劑盒採用間接競爭ELISA方法檢測水產和雞肉等組織樣本中的AMOZ,在微孔條上預包被上偶聯抗原,利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的原理來進行的,樣本中的AMOZ和微孔條上預包被偶聯抗原競爭抗呋喃它酮代謝物的衍生物抗體,加入酶標記物后,用TMB底物顯色,樣品中的AMOZ含量與樣品的吸光度值呈反比,與標準曲線比較即可得出呋喃它酮代謝物含量。
二、 試劑盒技術指標:
試劑盒靈敏度: 0.1 ppb
樣本檢測下限:
組織、蜂蜜 0.2 ppb
魚/蝦等水產品組織因存在一定的干擾,檢測下限為0.3 ppb
回收率:
魚/蝦水產組織 90%±15%
蜂蜜/雞肉/肝臟樣本 80%±15%
交叉反應率:
呋喃它酮代謝物 100%
呋喃唑酮代謝物 ﹤0.1%
呋喃妥因代謝物 ﹤0.1%
呋喃西林代謝物 ﹤0.1%
三、試劑盒組成
1.微量測試孔:96T/8孔
2.標準品液: 0 ppb 0.1 ppb 0.3 ppb 0.9 ppb 2.7 ppb 8.1 ppb (1ml/瓶)
3.酶標記物 12ml
4.抗體工作液 7ml
5.底物緩衝液 7 ml
6.底物液 7 ml
7.終止液 7 ml
8.20倍濃縮洗滌液 50 ml
9.復溶液 50 ml
10.15.1 mg衍生化試劑
四、 所用儀器、試劑
具備的儀器: 微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振盪器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)
微量移液器: 單道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道250µl
試 劑: 甲醇、氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、濃HCl、磷酸氫二鉀、鄰硝基苯甲醛、亞硝基鐵氰化鉀(K2Fe(CN)5·NO·3H2O)ZnSO4·7H2O
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時,都必須注意:
(a)實驗中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
(b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否乾淨,必要時可對實驗器具進行清潔,以避免污染干擾實驗結果。
樣本前處理需配製:
1.衍生化試劑 稱15.1 mg鄰硝基苯甲醛加甲醇10 mL溶解(濃度10 mM)
2.C液:(供奶樣用)稱12.5 g亞硝基鐵氰化鉀用去離子水定溶至100 mL。
D液:(供奶樣用)稱29.8 g 硫酸鋅用去離子水溶解定溶至100 mL。
3.0.1 M K2HPO4 稱22.8 g K2HPO4·3H2O
加去離子水溶解定溶至1 L
4.1M HCl取8.6 ml濃HCl加水定溶至100 mL。
5.1M NaOH稱取4 g NaOH加水定溶至100 mL。
樣本的處理
(a) 肉樣或魚蝦
用均質器均質樣本,接(d)的描述方法
(b) 奶樣
1. 取出5 mL的奶樣本到玻璃離心管中,分別加入C液和D液各250 µL。
2. 用振盪器充分混合樣本,用恆溫離心機4000 r/min以上離心10 min(4-12 ℃).若沒有恆溫離心機,則先將樣本降溫至大約8 ℃,然後離心。
3. 接(d)的描述方法
(c) 蜂蜜
1. 取1±0.05 g樣本到離心管中。
2. 加入4 mL的去離子水溶解,再加入0.5 mL 1 M HCl和100 µL衍生化試劑,充分振盪。
3. 接(d)第2步描述方法
(d)接上面的方法
1. 取1±0.05 g的均質樣本(肉樣/魚蝦)、牛奶的離心上清液1.1 mL(相當1 mL奶樣),分別加入4 mL的去離子水,0.5 mL 1 M HCl和100 µL衍生化試劑,充分振盪。
2. 置於56 ℃環境中孵育(2 h)。
3. 分別加入5 mL 0.1 M K2HPO4, 0.4 mL1 M NaOH和5 mL的乙酸乙酯,充分振盪30 s。
4. 在室溫下(20-25 ℃)4000 r/min以上離心10 min。
5. 取出2.5 mL的乙酸乙酯到另一潔淨容器中于50 ℃氮氣/空氣吹干。
6. 用1 mL正己烷溶解乾燥物,用1mL已稀釋好的復溶液充分混合;在室溫下(20-25 ℃)4000 r/min以上離心10 min。
7. 取50µl下層相用於分析。
樣本稀釋倍數:2
六、操作步驟
1. 將試劑盒從冷藏環境中取出並將所需試劑從試劑盒取出,置室溫(20-25 ℃)平衡30 min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2. 按需要取出微孔條及板架,將不用的微孔板重新密封,保存於2-8 ℃,不要冷凍。
3. 加標準品/樣本50 µL /孔,然後加入抗體工作液50 µL/孔,再振盪混勻,用封板膜蓋板,室溫反應30 min。
4. 洗板4-5次,每次浸泡30 s,拍干。
5. 加入酶標記物100 µL/孔,用封板膜蓋板,室溫反應20 min。
6. 洗板4-5次,每次浸泡30 s,拍干。
7.顯色:每孔加入底物緩衝液50µl,再加底物液50µl,輕輕振盪混勻,室溫環境下避光顯色10min。
8.測定:每孔加入終止液50µl,輕輕振盪勻,設定酶標儀于450nm處(在20min內讀完數據),測定吸光度值。
七、結果判定
以標準品百分吸光率為縱坐標,以AMOZ標準品濃度(ng/ml)的半對數為橫坐標,繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中AMOZ實際濃度。
八、注意事項
1.室溫低於20 ℃或試劑及樣本沒有回到室溫(20-25 ℃)會導致所有標準的OD值偏低。
2.洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3.混合要均勻,洗板要徹底,否則會出現重複性不好的現象。
4.反應終止液為2 M硫酸,避免接觸皮膚。
5.將不用的微孔板放進自封袋重新密封; 標準物質和無色的發色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
6.不要使用過了有效日期的試劑盒,不要使用不同批號試劑盒中的試劑。
7.顯色液若有任何顏色表明變質,應當棄之,0標準的吸光度值小於0.6時,表示試劑可能變質。
8.該試劑盒最佳反應溫度為25 ℃,溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
九、儲藏條件和保質期
儲藏條件:試劑盒于2-8 ℃保存,不要冷凍。
保質 期:該產品有效期為1年,生產日期見包裝盒