1.         原理

本試劑盒採用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的孔雀石綠結晶紫和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭孔雀石綠抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠結晶紫的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應孔雀石綠結晶紫的含量。

 

2.     試劑盒組成

（1）       酶標板：   96 T/8孔

（2）       標準品液:（1.0 mL/瓶）0 ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45 ppb、1.35 ppb、4.05 ppb。

（3）       酶標記物：     1瓶（12 mL）。

（4）       抗體工作液：   1瓶（7 mL）。

（5）       底物緩衝液：   1瓶（7 mL）。

（6）       底物液：       1瓶（7 mL）。

（7）       終止液：       1瓶（7 mL）。

（8）       20倍濃縮洗液：1瓶（50 mL）加蒸餾水稀釋到1000 mL。

（9）       1 mg/mL標準品液：（0.2 mL）。

（10）   提取液A （50 mL）

（11）   提取液B （50 mL）

 

3.         需要但試劑盒中不提供的器材和試劑

…微孔板酶標儀(450 nm)

…均質器

…振盪器

…離心機

…各種量程的微量移液器

…蒸餾水

…環已烷

 

5.         儲存條件

（1） 2-8 ℃保存，切勿冷凍。　

（2） 將不用的酶標板放進原袋中重新密封。

（3） 酶標記物和顯色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

 

6.         樣品處理

（1）       魚/蝦樣品的準備（稀釋倍數10）

     先將魚肉勻質后，稱取0.5 g樣品，加入500 μL的0.125 mol/L(Ph4.5)乙酸緩衝液，200ul的0.25g/mL鹽酸羥胺，300ul的0.05mol/L對甲苯磺酸，震盪15分鐘使之成勻漿，12000rpm離心5min，然後取上清用PBST稀釋5倍，用作ELISA檢測

（2）       水質樣品（稀釋倍數1）離心后取50µl作ELISA分析。

 

7.         免疫分析時試劑的準備

（1）注意事項

A）使用之前將所有試劑平衡至室溫。

B）使用之後立即將所有試劑放回2-8℃。

C）在使用中不要讓微孔乾燥。

D）EIA分析的重複性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細按照推薦的洗板順序操作是EIA測定程序中的要點。

E）在所有恆溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

（2）濃縮洗滌液使用前應根據所需量進行20倍稀釋，即按1mL濃縮洗滌液加入19mL蒸餾水的比例進行稀釋。

 

8.         標準樣品配製方法：

（1）用稀釋好的洗液將1mg/mL的標準品液稀釋1000倍，變成1000ng/mL，振盪混勻。

（2）準備5個1 mL瓶子，其中一個加入1000 μL洗液，其餘的分別加入600 μL洗液。

（3）在1000 μL洗液瓶子中先吸出4.05 μL的洗液，然後加入4.05 μL的1000 ng/mL標準品，混勻，使其濃度為4.05 ng/mL，作好記號；

（4）再從4.05ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為1.35 ng/mL，混勻，作好記號；

（5）再從1.35 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.45 ng/mL，混勻，作好記號；

（6）再從0.45 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.15 ng/mL，混勻，作好記號；

（7）再從0.15ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.05 ng/mL，混勻，作好記號。

 

9.         測定程序

（1）將標準品、樣品所需微量反應板（均需2個平行試驗）放在反應架上。

（2）加入50μl的標準液或處理好的樣品到各自的微孔板中。

（3）加入50μl已稀釋的抗體應用液加入微量反應板，輕輕振盪混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應20分鐘。

（4）棄去孔中液體，並將微孔板剩餘殘液在吸水紙上拍干。每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振盪，放置2分鐘，棄去孔中液體，並在吸水紙上拍干，重複5次。

（5）加入100μl酶標記物應用液到微孔板中，輕輕振盪混勻，用蓋板膜蓋板后， 室溫下反應15分鐘。

（6）棄去孔中的液體，並在吸水紙上拍干，每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振盪，放置2分鐘，棄去孔中液體，並在吸水紙上拍干，重複5次。

（7）加底物緩衝液50μl，再加入底物液50μl，輕輕振盪混勻，用蓋板膜蓋板后，在室溫避光處孵育10分鐘。

（8）加入50μl終止液到微孔板中，混合好在450nm處測量吸光度值，在加入停止液后10分鐘內讀取光度值。

 

10.   結果

以標準品百分吸光率為縱坐標，以孔雀石綠標準品濃度（ng/mL）的半對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

 

11.   測定技術指標

（1）      靈敏度：

孔雀石綠檢測試劑盒的平均檢測下限約為0.01ng/g（0.01ppb）。

（2）           準確度（回收率）：回收率為90%±15%。

 

12.   交叉反應活性

孔雀石綠檢測試劑盒能檢測孔雀石綠及其相似物，它們的結合程度不同。以下表格中展示的是相關值及交叉反映率（%CR），所有濃度均為ppb級。

種類	% CR
孔雀石綠	100%
隱性孔雀石綠	<10%
結晶紫	100%
隱性結晶紫	<10%