碧波Caspase-8活性分光光度法檢測試劑盒
一、產品簡介
Caspase 8活性分光光度法檢測試劑盒(Caspase 8 Activity Colorimetric Assay Kit)是採用分光光度法檢測細胞或組織裂解液中Caspase 8酶活性或純化的Caspase 8酶活性的試劑盒。
Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 8也稱FLICE、MACH或Mch5，有時被寫作caspase-8或caspase8，通常以酶原的形式存在，在細胞凋亡的信號轉導過程中被激活。Caspase 8被認為是細胞凋亡信號轉導過程中比較上游的一個caspase。在Fas-receptor和TNFR-1介導的細胞凋亡過程中caspase 8被激活，形成一個由p18和p10組成的二聚體，進一步激活下游的caspase 4，caspase 6，caspase 9和caspase 10。Caspase-8在正常狀態下以酶原的形式存在於胞漿中，沒有活性；但在細胞發生凋亡階段，它被激活。
Caspase-8活性分光光度法檢測試劑盒就是將Caspase-8序列特異性的多肽（Ac-IETD-pNA (acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp p-nitroanilide）偶聯至發色基團：pNA (p-nitroaniline)；當該底物被Caspase-8剪切后，黃色基團pNA即游離出來，可通過酶標儀或分光光度計（λ=405nm 或400nm）測定其吸光值，考察Caspase-8的活化程度。pNA在405nm附近有強吸收。
本試劑盒適用於培養細胞及新鮮組織Caspase-8活性的檢測。
二、試劑盒組份
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組份
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Cat:BB3120
20 assays
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Cat:BB3150
50 assays
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Cat:BB31100
100 assays
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儲存條件
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裂解液
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5.0 mL
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10.0 mL
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15.0 mL
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-200C
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2×反應液
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1.0 mL
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2. 5 mL
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5.0 mL
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-200C
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Ac-IETD-pNA
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100μL
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250μL
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500μL
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-200C，避光
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DTT
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50 μL
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100 μL
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150 μL
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-200C
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三、試劑盒以外自備儀器和試劑
低溫高速離心機、酶標儀或分光光度計（100μL的比色皿）、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣本）
1.5m L離心管、PBS、蛋白定量試劑及儀器
四、保存條件：
-20℃保存，Ac-IETD-pNA需避光保存。
五、注意事項：
1、須自備可以測定A405或A400的酶標儀或容量不超過100µl的分光光度檢測杯及相應分光光度計。優先考慮測定A405，如有困難可以測定A400。
2、Ac-IETD-pNA需儘量避免反復凍融，請注意適當分裝和避光保存。
3、測定蛋白濃度需Bradford蛋白濃度測定試劑盒。
4、有文獻報道少數類型的細胞凋亡檢測不到caspase 8的激活。可能存在非依賴於Caspase-8活化的機制，這種情況時利用本試劑盒檢測Caspase-8活性無明顯改變，需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。
5、本試劑盒的裂解液可以和碧波生產的其它Caspase活性檢測試劑盒的裂解液通用，即本試劑盒裂解液制備的蛋白樣品可以用於碧波其它Caspase活性檢測試劑盒的檢測。
6、細胞數量需達到3～5×106個或新鮮組織100mg，以便能達到測定需要的100～200μg蛋白的要求，因為Caspase-8的活性與細胞裂解液的蛋白含量有關，如測定的OD值偏低，可通過增加細胞數量或組織量的方法來提高蛋白量。
7、樣品中激活的caspase水平很低。首先確認凋亡現象是否明顯，如果凋亡比較明顯並且確認該caspase是可以被激活的，可以適當調節誘導細胞凋亡的時間，希望能找到一個caspase激活比較強的時間點，這樣就可以檢測出該caspase的激活。可以作一時間曲線，例如誘導凋亡0、2、4、8、16和24小時，或0、1、2、4、8和16小時，或0、1、2、4、6和8小時等。具體的誘導凋亡時間需根據具體情況而定。
8、為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
六、操作規程
1、 準備工作：
a.、裂解液溶解后混勻並置於冰浴上備用。
b、裂解液工作液的準備：使用前每50μL 裂解液加入0.5μL DTT
c、2×反應液溶解后混勻並置於冰浴上備用
2、 樣品的處理
a、對於懸浮細胞
把沒有誘導凋亡的對照樣品和誘導凋亡的樣品，離心（2000rpm，5min）收集細胞，小心吸除上清，
同時確保儘量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉澱，冰浴裂解30min，其間渦旋振盪3～4次，每次10 s；或凍融2～3次。下轉第3步進行實驗。
b、對於貼壁細胞
按常規的方法用胰酶消化貼壁細胞，並收集細胞。用PBS洗滌一次，吸盡上清后，按照每200萬細胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉澱，冰浴裂解30min，其間渦旋振盪3～4次，每次10 s；或凍融2～3次。下轉第3步進行實驗。
c、對於組織樣品
每50mg固體組織置於培養皿中，手朮剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入50μL 冰冷裂解液工作液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然後把勻漿液轉移到1.5ml離心管中，冰浴再裂解5分鐘。下轉第3步進行實驗。
3、 4℃ 離心（12，000rpm， 10～15min）。
4、 小心吸取上清（含裂解的蛋白質）轉移至新的管中，並放置冰上待用。
5、 立即測定caspase 8的酶活性或-70℃保存樣品，同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度。如果細胞較小，可以適當增加細胞的用量。
6、 Caspase 8酶活性的檢測：
a、 取出適量的Ac-IETD-pNA和2×反應液，置於冰浴上備用。
b、 使用前每50μL 2×反應液加入0.5μL DTT。
c、 吸取50μL含100~200μg蛋白的細胞或組織裂解上清；如體積不足50μL用裂解液補足至總體積50μL（各組均採用同樣的蛋白量進行測定和比較）。
d、 如下設置反應體系：
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空白對照
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樣品
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2×反應液
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50μL
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50μL
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裂解液
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50μL
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0μL
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待測樣品
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0μL
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50μL
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Ac-IETD-pNA
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5μL
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5μL
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總體積
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105μL
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105μL
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e、 加入Ac-IETD-pNA后混勻，注意避免在混勻時產生氣泡。37℃孵育4hr。發現顏色變化比較明顯時即可測定A405。如果顏色變化不明顯，可以適當延長孵育時間，甚至可以孵育過夜。
f、 用酶標儀或分光光度計（100μL的比色皿）在λ=405nm或400nm測定其吸光值。
g、 通過計算OD誘導劑/OD陰性對照的倍數來確定凋亡誘導劑組Caspase-8活化程度。
參考Chemicon公司的caspase 8酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-IETD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個酶活力單位定義為當底物飽和時，在37℃可以剪切1nmol Ac-IETD-pNA 產生1nmol pNA的caspase 8的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的caspase 8。說明：在本試劑盒的檢測體系中，底物的起始濃度為0.2mM，此時底物是飽和的，對於許多樣品而言在37℃孵育4個小時以內底物都是飽和的；對於樣品中caspase 8酶活力特別高的情況，須用裂解液適當稀釋樣品后再進行測定。